鼠痘(脫腳病)病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

產(chǎn)品名稱：鼠痘(脫腳病)病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

英文名稱：Mouse Pox Virus(MPV) Probe qPCR Kit

鼠痘病毒(Mouse Pox Virus，MPV)會引起鼠痘，該病多呈爆發(fā)性流行，致死率較高，常造成小鼠全群淘汰，危害極大。臨床表現(xiàn)以四肢、尾和頭部腫脹、潰爛、壞死甚至腳趾脫落為特征，故又稱脫腳病。本病毒的自然宿主為小鼠，不同品系小鼠的易感性差異很大。本病常感染野生小鼠，使野生小鼠成為另一種危險(xiǎn)的傳染源，因此鼠痘(脫腳病)病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重  要作用。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測鼠痘(脫腳病)病毒的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.    即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.    引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3.    提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.    特異性高，引物是根據(jù)鼠痘(脫腳病)病毒 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會跟其他微生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.    既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5

個數(shù)量級。

6.    本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

7.    本產(chǎn)品只能用于科研。

【試劑組成】

【自備試劑】樣品 DNA。

【注意事項(xiàng)】

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能

污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.    用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。

3.    在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.    換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.    換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.    重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.    如果有 N 個樣品待提取，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的是 PC（樣品制備陽

性對照）和 NC（樣品制備陰性對照）?？梢匀￡栃詫φ盏?1000 倍稀釋液10μL 再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.    用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA/提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.    如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.    在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)

置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好

后最后加）：

11.  蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

四、數(shù)據(jù)處理

12.  如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品核酸濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.  如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 36。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 36 則為陽性。如果在 36-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。