α-淀粉酶（α-amylase，α-AL）試劑盒說(shuō)明書

                                        微量法100管/48樣

注    意：正式測(cè)定前請(qǐng)取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2.1.1)隨機(jī)催化淀粉中α-1,4-糖苷鍵水解，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時(shí)使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。

測(cè)定原理：

淀粉水解酶催化淀粉水解生成還原糖，還原糖還原3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質(zhì)，在540 nm有吸收峰；通過(guò)測(cè)定540 nm吸光度增加速率，計(jì)算淀粉酶活性。α-AL耐熱，但是β-淀粉酶可在70℃鈍化15min。因此粗酶液經(jīng)過(guò)70℃鈍化15min，就只有α-AL能夠催化淀粉水解。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體15mL×1瓶，室溫保存。若有黃色晶體析出，可90℃加熱溶解后再用。

試劑二：液體7.5mL×1瓶，4℃保存。若有沉淀析出，可70℃加熱溶解后使用。

粗酶液提取：

組織：稱取0.1~0.2g樣本（建議稱取約0.1g樣本），加1 mL蒸餾水勻漿；將勻漿倒入離心管中，在室溫下放置提取15min，每隔5min振蕩1次，使其充分提??；3000g，25℃離心10min，吸取上清液并且加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，即為淀粉酶原液。

血清（漿）：直接檢測(cè)。

操作步驟和加樣表（在EP管中依次加入下列試劑）：

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到540 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   試劑一和試劑二40℃預(yù)熱10min。

3、測(cè)定步驟：

70℃水浴15min左右，流水冷卻。

在40℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫5min

混勻，95度水浴5min，冷卻，取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中，540nm處讀取吸光值，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

α-淀粉酶活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸曲線為y=3.7215x -0.1778； x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、α?淀粉酶活性

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=[(ΔA＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1.075×(ΔA＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(ΔA＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T=0.1075×(ΔA＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）樣本中α?淀粉酶活性計(jì)算

單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(ΔA＋0.1778)÷3.7215×V反總]÷V樣÷T=0.1075×(ΔA＋0.1778)

反總：反應(yīng)體系總體積，0.15mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.075 mL；V樣總：提取液總體積，10 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，5min。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸曲線為y=2.481x -0.1778； x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。

2、α?淀粉酶活性

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/g鮮重)=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1.612×(ΔA＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。

α?淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反總]÷（V樣×Cpr）÷T =0.1612×(ΔA＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）樣本中α?淀粉酶活性計(jì)算

單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1mg還原糖定義為1個(gè)酶活性單位。

α?淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(ΔA＋0.1778)÷2.481×V反總]÷V樣÷T=0.1612×(ΔA＋0.1778)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.15mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.075 mL；V樣總：提取液總體積，10 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，5min。