淀粉脫分支酶（Starch debranching enzyme，DBE）試劑盒說明書

                                        微量法100管/48樣

注    意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

DBE能夠?qū)Ｒ恍缘亓呀庵ф湹矸鄣摩?/span>-1，6糖苷鍵，產(chǎn)生線性的葡萄糖鏈，在調(diào)整支鏈淀粉分子的鏈長方面有重要的作用。

測定原理：

采用3，5-二硝基水楊酸法測定DBE催化支鏈淀粉產(chǎn)生的還原糖，通過測定還原糖含量的變化來計算DBE活性。

需自備的的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體15mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1支，4℃保存；臨用前每支加入6mL試劑一，充分混勻后備用；用不完的試劑4℃保存；

試劑三：液體12mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：液體35mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到540 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

混勻，37℃準確保溫2h

混勻，95℃水浴5min，取200uL至微量石英比色皿或96孔板中，540nm處讀取各管吸光值。ΔA=A測定

-A對照。每個測定管需設(shè)個一個對照管。

注意：可以在不同對照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進行5min 95℃沸水浴處理。

DBE活力單位的計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準條件測定回歸方程為y = 3.8458x - 0.165；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。

（1）按照蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每h催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

DBE活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=0.26× (ΔA+0.165) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

DBE活力(mg /min /g鮮重)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V反總]÷(W× V樣÷V樣總)÷T

=0.26× (ΔA+0.165) ÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL； V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準條件測定回歸方程為y = 1.9229x - 0.165；x為標準品濃度（mg/mL），y為吸光值。

（1）按照蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每h催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

DBE活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=0.52× (ΔA+0.165) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg 葡萄糖定義為一個酶活力單位。

DBE活力(mg /min /g鮮重)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V反總]÷(W× V樣÷V樣總)÷T

=0.52× (ΔA+0.165) ÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL； V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

標準曲線線性范圍為0.1mg/mL-1mg/mL。

ΔA線性范圍為0.01-1。